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WB实验概述及样品制备

蛋白免疫印迹法(Western Blot, WB)是首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离,然后转移至固相载体(NC或PVDF膜等)上,固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变,转移后的固相载体膜即称为blot,用于对蛋白质的进一步检测,印迹中的目的蛋白与一抗特异性结合形成抗原抗体复合物,进一步使用抗一抗的抗体——酶标二抗处理,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即可定位目的蛋白的位置。再用适当的底物溶液处理,使酶催化底物生成有颜色的产物,进行蛋白检测分析。

 

Western Blot的内容主要包括以下几个步骤:

样品制备与蛋白定量 → 上样与SDS-PAGE凝胶电泳 →蛋白的转印 → 封闭与抗体孵育 → 显色检测

 

一、WB样品制备

 

1.样品处理

针对样品,主要分为组织和细胞两类,在制备样品供分析使用时,一般采取物理和化学的方法进行破碎裂解。对于不同样品处理,可根据 (A) 进行选择使用。

(A)不同样品处理方式

实验样品

处理方式

悬浮细胞

离心收集细胞,PBS清洗去除残留胎牛血清。利用超声破碎或裂解缓冲液处理。

贴壁细胞

刮刀将细胞刮下收集,PBS清洗去除残留胎牛血清。利用超声破碎或裂解缓冲液处理。

组织

研磨匀浆组织。利用超声破碎或裂解缓冲液处理。

 

2.裂解缓冲液的选择

对细胞或组织样品进行裂解是为释放其目的蛋白,不同裂解缓冲液对蛋白溶解能力各不相同。组织样品可选择裂解强度较强的裂解液,而细胞样品更适合裂解强度较温和的裂解液。其中,含有SDS和其他离子型去污剂的裂解缓冲液溶解能力最强,但是去污剂(SDS、Triton X-100)的存在会使蛋白变性,或者破坏蛋白质之间的相互作用。

 

结合自身实验需求,主要考虑其裂解缓冲液强度与成分,进行选择使用。

裂解缓冲液产品推荐

    货号

    产品名称

    产品规格

    用途

    abs47014877

    RIPA Lysis Buffer (Strong)

    100 ml

    裂解样品

    abs47014881

    NP-40 Lysis Buffer

    100 ml

    裂解样品

    abs47014880

    Lysis Buffer for WB/IP Assays

    100 ml

    裂解样品(非变性)

    abs47014932

    Red Blood Cell Lysis Buffer

    100/250/500 ml

    裂解组织或血液样品并去除红细胞

     

    3.抑制剂的选择

    一旦裂解发生,蛋白的水解、去磷酸化和变性随即开始,为减缓这一系列的反应,需将样品置于冰上,并适当加入抑制剂。加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质的降解。另外在磷酸 化蛋白的研究中,磷酸酶抑制剂也是必不可少的。

    (B)几种常见抑制剂

    抑制剂

    靶点

    终浓度

    抑肽酶

    胰蛋白酶、糜蛋白酶、血纤维蛋白溶酶

    2 μg/mL

    亮抑酶肽

    溶酶体

    1-10 μg/mL

    胃蛋白酶抑制剂A

    Asp蛋白酶

    1 μg/mL

    PMSF

    Asp蛋白酶

    1 mM

    EDTA

    镁和锰金属蛋白酶

    1-5 mM

    EGTA

    钙金属蛋白酶

    1 mM

    氟化钠

    丝氨酸和苏氨酸磷酸酶

    5-10 mM

    原钒酸盐

    络氨酸磷酸酶

    1 mM

    焦磷酸盐

    丝氨酸和苏氨酸磷酸酶

    1-2 mM

    β-甘油磷酸盐

    丝氨酸和苏氨酸磷酸酶

    1-2 mM

     

    抑制剂产品推荐

    产品货号

    产品名称

    产品规格

    用途

    5871S

    Protease Inhibitor Cocktail (100X)

    1 ml

    抑制蛋白降解

    abs812852

    Phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)

    50/100/200 mg

    抑制蛋白降解

    abs47027936;

    abs42027527

    Sodium orthovanadate(原钒酸钠)

    100/500 mg
    5/50 g

    抑制蛋白降解

    abs42017684

    EDTA

    1/10 g

    抑制蛋白降解

     

    4.蛋白的定量

    对于获取的蛋白样品进行浓度测定,目前对于蛋白定量的方法主要有三种Bradford、Lowry和BCA法,牛血清白蛋白是常用的蛋白标准。
    我们针对三种不同的蛋白定量法,对它们各自特点进行了简要的说明(C)。

    (C)蛋白定量三种主要方法及特点

    蛋白定量方法

    原理

    特点

    Lowry法

    蛋白质于碱性溶液中形成铜-蛋白质复合物,使酚试剂还原成蓝色化合物,利用颜色深浅与蛋白质浓度的线性关系对样品蛋白进行定量。

    灵敏性高(5 μg/ml);易受硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸及各种硫醇的干扰;耐受去污剂影响;耗时长(40~60min)。

    Bradford法

    考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色,颜色深浅与蛋白浓度呈正比关系。

    灵敏性较高(1-5 μg/ml);易受强碱性缓冲液、去污剂的干扰;耐受绝大部分样品中化学物质的影响;耗时短(5~15 min)。

    BCA法

    蛋白质价铜离子还原成亚铜离子,后者在碱性溶液中与BCA结合生成紫红色络合物。

    灵敏性很高(0.5~20 μg/ml);易受螯合剂和略高浓度还原剂影响;耐受一般浓度去垢剂干扰,抗干扰能力较强;耗时较短(<40 min)。

     

    蛋白定量产品推荐

    产品货号

    产品名称

    产品规格

    用途

    K813;7780S

    BCA Protein Assay Kit

    1盒

    蛋白定量


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