>  资讯
资讯

微生物组学一整套解决方案

浏览次数:1137

分享:

 关于微生物组学,我们可以提供整套解决方案~

 

 

从最基础的样本提取就足以位居业界翘楚,详细解密微生物核酸纯化

 

珠磨研磨技术与IRT技术

MO BIO在微生物核酸纯化的研究领域,有其重要的地位。那么MO BIO有什么独到之处呢?首先,简要介绍一下MO BIO的前生今世。QIAGEN于2017年收购MO BIO。收购后其原有货号依然不变哦!QIAGEN一直被业界视为提取金标准,现在与MO BIO的核心技术双剑合璧,强者更强!

MO BIO--多样的研磨珠方案和IRT技术 


让我们先来扒一扒其专利的珠磨研磨技术与众不同之处,以及利用高效的珠磨研磨技术和抑制因子去除技术(Inhibitor Removal Technology®, 简称IRT)如何确保后续获得高品质核酸。


首先,介绍一下珠磨研磨技术 

 


 

在MO BIO产品系列中,针对不同的样本类型设计了不同的研磨珠方案,主要包含以下几种研磨珠类型:

0.15mm 石榴石研磨珠

这类细沙状的研磨颗粒具有的毛边特别适合对细胞壁的破碎,同时也不容易造成DNA的断裂。常用于对微生物培养物或来自水体,尿液、血培养的菌体沉淀物。

0.25mm 碳化硅研磨珠

这类研磨颗粒的形状呈薄片状,具有锋利的边缘。不但能有效的切开微生物的细胞,同时能切断基因组DNA,因此这种研磨颗粒会用于RNA的提取试剂盒中。

0.1mm 玻璃研磨珠

这是所有研磨珠中最细小的研磨颗粒,外形呈球形。由于玻璃研磨珠的质地格外坚硬,因此特别适合于一些高强度的破碎。这种研磨珠常用于某些质地坚硬的土壤样本,例如黏土、沉积土或沙土。对于样本中的真菌和孢子都能有效破碎。

0.5mm 玻璃研磨珠

这类研磨珠与前述的0.1mm玻璃研磨珠相似,只是颗粒的直径更大,在破碎中提供的破碎力度更大,适合用于一些质地坚硬的样本。这种研磨珠主要方便客户根据自己的样本自行搭配尝试。

0.7mm 石榴石研磨珠

这种研磨颗粒的外形不规则且边缘锋利,适合用于任何半固体的介质或颗粒。MO BIO最有名的土壤DNA的提取试剂盒DNeasy PowerSoil Kit (货号12888) 中就使用的这种研磨珠。

2.38mm 不锈钢研磨珠


  ** 除了常见的涡旋仪(要求最大速度达到3200 RPM),还有通量更高的QIAGEN TissueLyser II,最高可同时处理2x96份样本。

 

应用举例


为了研究不同的裂解方案对于土壤中总DNA提取质量的影响,研究人员利用两种不同的土壤样本分别采用两种破碎方案提取DNA,并对结果进行了评估。


样本和方案 

样本A:样本成分45%黏土,2.5%碳,pH8

样本B:样本成分40%黏土,4.9%碳,pH8

破碎方案:土壤上样量250mg。分别0.1mm玻璃和0.7mm 石榴石这两种研磨珠,在2000RPM到5000RPM不同速度下破碎45s,比较获得的DNA的产量和完整性。


研究结果 

1. 针对样本A,0.1mm玻璃研磨珠的DNA产量高于石榴石研磨珠,且在3900-4200RPM范围内,DNA的产量随着振荡速度的提高而增加;超过4200RPM后,DNA产量下降。

2. 针对样本B,低速时,两种研磨方案的结果相当。0.1mm玻璃研磨珠在低速(约2000RPM)的提取结果最佳;而石榴石研磨珠在3200RPM时的产量和完整性最好,超过3200RPM后,DNA的片段化程度加重。


研究结论 

1. 针对黏土含量高,有机质含量低的土壤样本最好选用0.1mm的玻璃研磨珠,同时此类样本需要更高速的破碎条件;

2. 有机质含量高的土壤样本在低速破碎条件下,两种研磨珠的效果类似,但在高速条件下,DNA断裂严重,如果使用石榴石研磨珠,最高研磨速度不要超过3200RPM。

3. 因此在实际操作中,如果发现DNA产量和完整性不佳,需要研磨珠和破碎速度进行优化,既可以获得较好的提取效果


接下来,给大家介绍一下IRT技术

MO BIO专利的抑制因子去除技术(Inhibitor Removal Technology®, IRT)是全球公认的能有效去除腐殖质、多酚和多糖等抑制因子的特有专利技术。


在MO BIO的产品名中凡是存在“Power”一词的试剂盒,都应用了IRT技术。


IRT技术包含两种功能性组分:

  ✔ Buffer 1 可溶解DNA并沉淀蛋白质

  ✔ Buffer 2 则结合并沉淀腐殖质、多聚糖等大分子物质。


如下图可见,研磨后的浑浊样本,经IRT技术处理后,最终得到透明净澈的上清液(D),这说明该技术处理能有效去除杂质。


实验一


实验方案 

• 用含有IRT技术的DNeasy PowerSoil® Kit(简称P)和不含IRT技术的其他厂家试剂盒(简称C)分别对0.1g堆肥样本进行DNA的提取,并对产物进行终点法PCR和电泳检测。


实验结果 

 1. A260结果显示,C得到的DNA产量几乎是PowerSoil®(P)的两倍;但从电泳结果明显看出,C的产物有不同程度的降解,这说明由于DNA/RNA的降解导致了C的A260值虚高。

 2. C的A260/230的比值都偏低而A340值则偏高(Fig 1B),这说明C的产物中含有抑制剂的残留。PCR产物电泳结果也进一步验证了这一点(Fig 1C)。


 

实验二


实验方案 

• 将50ml水样用0.45μm MCE滤膜过滤,滤膜的DNA分别用含有IRT技术的DNeasy PowerWater® Kit和不含IRT的普通提取试剂盒进行提取。利用通用的16S rRNA引物进行real-time PCR。用纯化后的粪肠球菌DNA梯度稀释后做标准曲线进行定量。


实验结果 

1. 普通试剂盒提取的DNA从电泳图条带分析,浓度应稍高于PowerWater®(Fig 2A)。

2. 但qPCR结果显示,无IRT技术的样本不但扩增的起峰更晚,而且样本扩增的重复性也非常差(Fig 2B)。这说明产物中残留的抑制剂极大的影响了real-time PCR的结果。

 

实验三


实验方案 

 •  0.15g生物被膜在用RNeasy PowerBiofilm Kit进行RNA的提取时,两组样本采用相同体积的IRT Buffer 1处理,但分别用100μl和200μl的IRT Buffer 2处理。所获的RNA经逆转录成cDNA后,利用终点法PCR对产物进行检测。


实验结果 

1. 200μl IRT Buffer 2处理得到的RNA产量相比100μl Buffer 2的稍少一些(Fig 3A)。

2. 但经过两步法RT-PCR后,两种方案所得的产物结果差异明显,100μl Buffer 2方案由于抑制剂残留使PCR受到影响,尤其1a最明显(Fig 3B)。

3. 利用DNeasy PowerClean Clean Up Kit优化后的步骤对1a样本再一次纯化,结果显示抑制剂被去除,PCR扩增得到有效提升(Fig 3C)。

 

结论

 ★ 环境样本中残留的大量腐殖质是影响DNA/RNA提取质量的重要因素;

 ★ MO BIO专利的IRT技术含有的两种Buffer能有效去除样本中的抑制剂,并整合到任何样本的核酸提取步骤中;

 ★ IRT处理后的DNA无论从产量的稳定性和qPCR的灵敏度上都有极大的提升;

 ★ 针对一些高含量抑制剂样本,如某些生物被膜,可能需要优化IRT中Buffer 2的用量,以进一步提升PCR扩增性能。

 

上海优宁维生物科技股份有限公司
抗体|试剂 | 定制服务 | 实验外包服务| 技术培训 | 仪器 | 软件 | 供应链

免费热线:4008-168-068
咨询邮箱:info@univ-bio.com
网站:www.univ-bio.com
微信公众平台:优宁维分子生物学,欢迎关注!

 

上海优宁维生物科技股份有限公司

试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链

免费热线:4008-168-068

咨询邮箱:info@univ-bio.com

订购商城:www.univ-bio.com

微信公众平台:优宁维抗体专家,欢迎关注!

小优博士(小程序):5大课堂, 让你的科研不再难!

公众号
小程序