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凝胶过滤选择原则
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大家好，我是ӒKTA的小Ӓ，这周又和大家见面啦。上周我们一起了解了凝胶过滤层析的填料介绍，那么这么多填料我们应该怎么选择呢？快来看一下今天的内容吧~
凝胶过滤层析（很多人喜欢叫做分子筛）是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
凝胶过滤的基本原则
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质。在加入样品之后，样品中的小分子物质能进入球状填料内部，在柱子中停留时间较长；而大分子物质不能进入球状填料内部，停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后，样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了（Fig 1）。样品可以单一成分洗脱（单一的缓冲液，不需要梯度）。缓冲液的成分可以多样化，可以根据样本的类型或者下一步的纯化，分析和储存的需要来做选择。
SEC填料的类型多样，可以分离100 Mr到100,000,000 Mr分子大小的样品，例如大蛋白，蛋白复合物和病毒等等。
 凝胶过滤基本的两个应用
1、群组分离
群组分离是指样品的成分可以根据样品的大小分为两个主要的部分。群组分离可以被用来去除高分子量或者低分子量的污染物，例如培养基中的酚红，或者缓冲液脱盐。
.png) 2、高分辨率分离
高分辨率分离是根据样品不同的分子量来进行样品分离。高分辨率分离可以被用来分离样品中一个或者多个成分，从多聚体中分离出单体，或者进行分子量分布的分析。高分辨率SEC不推荐使用于纯化策略中的初步纯化，更适合于经过其他纯化之后样品中仅剩几个成分的精细纯化。
.png) 填料选择推荐
1、组群分离
Sephadex非常适合于快速的组群分离例如脱盐或者缓冲液置换。这个填料可以被用在实验室或者工业水平。
2、高分辨率分离
Superdex是高分辨率的首要选择，分辨率高，分离时间短，回收率高。
Sephacryl非常适合于实验室和工业水平的快速和高回收率的分离。
Superose提供了宽的分离范围，适合于实验室水平。
3、快速纯化检测和筛选
Superdex 75 Increase 5/150 GL，Superdex 200 Increase 5/150 GL和Superose 6 Increase 5/150 GL是小柱床体积的小柱子，非常适合于快速蛋白同质化分析或者纯化检测。当筛选很多样品时，使用这种柱子可以节约时间，缓冲液和样本。
层析填料选择的考虑因素
1、层析填料的选择
分辨率是指填料的选择性，即为两个峰的距离；和填料的效率，就是产生窄峰的能力。分离范围定义了可以通过填料孔径的分子量范围，在这个分子量范围内的分子可以被高分辨率分离。
SEC填料的选择性依赖于颗粒大小的分布，可以参考下图的选择曲线。选择曲线越陡峭，分辨率越高。分辨率也依赖于SEC颗粒的大小，填料颗粒越小，分辨率越高。
.png) 当两个SEC的填料有相似的分离范围，可以考虑选择有更陡峭选择曲线的填料以得到更好的分辨率。当你对样品中某一个成分很感兴趣，可以考虑把目标蛋白的分子量落在选择曲线的中间。
2、填料颗粒大小
如果已经确定了柱子的体积大小，选择更小颗粒大小的填料可以增加分辨率。然而，使用更小的颗粒会增加反压，因此流速需要稍微降低。
3、柱子体积
柱床的高度会影响分辨率和分离时间。为了得到高的分辨率，长的柱子是更好的选择。
4、样品和缓冲液
对于凝胶过滤层析，样本的处理非常重要。在上柱前使用脱盐柱或者超滤管处理样品可以很大程度降低柱子堵塞的风险，减少洗脱程序的严格性，增加柱子的寿命。
缓冲液成分对凝胶过滤层析影响不大，只需要缓冲液成分不影响样品的形状和生物活性。选择的缓冲液条件应该适合于蛋白的稳定性和活性，例如25-150mM NaCl。
5、上样体积
小的上样体积可以帮助避免不同峰之间的重叠。对于高分辨率，推荐上样量为柱子总体积的0.5%到4%，具体的上样体积可以参考说明书。对于大部分应用，推荐上样体积应该不超过柱子体积的2%以达到最高的分辨率。对于组群分离，上样体积可以为柱子体积的30%。
6、流速
流速主要通过两个因素来影响分辨率：流速太高使填料和洗脱液不能充分接触；流速太低会使每个峰之间离得特别远，浪费时间。推荐的蛋白分离的流速为2-10cm/h。在高粘度和低温度（2-8℃）的情况下需要适当降低流速。
7、粘度
高的样品粘度会导致分离的不稳定性，形成很宽或者歪曲的峰。为了增加凝胶层析的选择性，样品需要被浓缩，样品的溶解性和粘度会限制样品的浓度。
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今天的介绍就到这里啦，下周我们会继续介绍凝胶过滤层析相关知识和产品，请大家继续关注哦~
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