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ÄKTA蛋白纯化入门：纯化常用方法

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大家好，我是ÄKTA的小Ä。告诉大家一个好消息，我们优宁维将在4月份正式代理GE的ÄKTA蛋白纯化系列产品了。以后买ÄKTA蛋白纯化相关的产品就可以从您身边的优宁维销售或者直接从我们的网站下单了，是不是非常方便呢。从这周开始，我们的ÄKTA蛋白纯化专栏也要正式上线了。之后的每周我们都会为大家带来ÄKTA相关的知识和产品的介绍。希望大家持续关注哦~

蛋白纯化是生物研究常用的一种技术。蛋白纯化的方法主要是根据样品和杂质的不同特性来对样品进行纯化分离。

蛋白纯化的指导原则

1、明确目标

对于纯化样品，应该要明确最终产品需要达到的纯度、活性和产量的要求，要避免过度纯化或者因为纯化步骤或者分辨率不够而达不到想要的纯度。

2、明确需要纯化的目标样品的特性和关键杂质

纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。

3、明确检测分析技术

能快速和准确的检测样品活性，纯度和回收率。

4、尽可能少用添加剂和尽可能早的去除对样品有损伤的杂质

5、在每一步纯化过程中使用不同的纯化技术

充分利用样品的特性对样品进行分离纯化

6、使用的纯化步骤尽可能少

额外的纯化步骤将会减少目标样品的产量和增加纯化时间。

通常需要多步纯化来达到预期的样品纯度，然而每一步纯化步骤都会导致产物的丢失。例如，假定每一步能够获得80%的产量，那么经过8个纯化步骤后，总产率将被减少到仅仅20%。因此，使用最少的步骤和最简单可行的设计来达到预期的产量和纯度是非常必要的。各种技术应该以逻辑的顺序组合起来，避免改变样本条件的步骤，恰当的选择和设计可以使纯化步骤尽可能的少。

在具有样品背景信息的情况下一般可以选择三步纯化策略。

在样品捕获阶段，将目标物进行分离，浓缩并对目标物进行稳定化处理，关键的污染物被大量去除。在中度纯化阶段，样品中的大量杂质都已被去除。在样品精细纯化阶段，由于之前大量杂质都已被去除，仅需去除剩下一些痕量的杂质。当然，也并不是所有的纯化策略都必须经过三个纯化步骤。如果对纯度要求较低时，一步或者两步纯化就可以获得想要的结果。

根据不同的蛋白特性，有4种纯化柱类型可以选择。

在纯化过程中，需要考虑到回收率，分辨率，速度和容量等因素，每种不同的纯化技术都会有不同的表现。可以根据样品的性质来进行正确的选择和组合。

三步纯化策略中一般的推荐选择是：

捕获阶段

在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。

捕获阶段一般选择离子交换层析或者亲和层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。在杂质存在的条件下，介质对样品的结合容量对于优化和减少工作规模是一个关键因素。在选择条件时，要尽量避免其它杂质吸附到介质上，增加介质对样品的结合容量。在捕获阶段，分辨率不是特别主要考虑的因素，因此可以增大上样量和速度。

中度纯化阶段

在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。

精细纯化阶段

在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。

此外，为了节省时间和成本，在选择纯化策略中需要考虑到产物从第一个纯化柱上被洗脱下来的条件应该更适合下一个纯化柱开始的条件。例如：从离子交换柱将样品洗脱后，样品通常会处在高离子强度的缓冲液中，再使用疏水层析就很方便。如果先使用疏水层析，样品洗脱后可能会处于很高的盐离子强度的环境，需要先降低离子强度以满足离子交换层析的上样要求才能继续进行离子交换层析。

今天的介绍就到这里啦，我们下周见~

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