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流式常用试剂配制

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一、流式细胞术常用试剂


1、10%NaN3:
 ★ 将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中,室温保存;活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。

2、3%BSA/PBS:100ml PBS中加入3g BSA,使之溶解,再加入0.2ml 10%的NaN3。

3、500mmol/L EDTA:将186g EDTA•Na2•2H2O溶解于400ml蒸馏水中,用NaOH将PH调至8.0,补充蒸馏水至500ml,分装,高压灭菌,室温保存。

4、4%多聚甲醛:在磁力搅拌下,将4g多聚甲醛溶于100ml PBS,加入数滴NaOH,在通风柜中于60度加热,使其溶解,调整PH至7.4,使用前新鲜配制。

5、消化液:0.25%胰蛋白酶(用培养液或PBS配制)或0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA的混合液。

6、红细胞裂解液:NH4Cl 4.16g,KHCO3 0.5g,EDTA•2Na 0.02g,溶于100ml水中,调PH至7.2,补充蒸馏水至500ml,4度储存,使用时需恢复至室温。

7、流式细胞抗体稀释剂:0.1mmol/L PBS液(PH 7.4)+1%BSA+0.1%Na2N3。

8、常用细胞破膜剂:PBS液(PH 7.4)+1%FBS(或BSA)+0.1%NaN3+0.1%saponin(Sigma的效果不错)。

9、流式细胞染色洗涤液:含2%的BSA、0.1%NaN3的PBS(PH 7.4)。

10、PI染液(保存液,10×,用于细胞周期和凋亡检测):10mg PI溶于10ml PBS,加入2mg无DNA酶的RNA酶,4度保存备用。应用时,10倍稀释,每管加0.3ml~0.5ml PI染液。

11、Hanks液的配制(BSS,主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液,不能单独作为细胞、组织培养液)
原液A
  NaCl 160g
  MgSO4•7H2O 2g
  KCl 8g
  MgCl•6H2O 2g
  CaCl2 2.8g
溶于1000ml双蒸水
原液B
1)Na2HPO4•12H2O 3.04g
  KH2PO4 1.2g
  葡萄糖 20.0g
  溶于800ml双蒸水
 
2)0.4%酚红溶液:取酚红0.4g置玻璃研钵中,逐滴加入0.1N NaOH并研磨,直至完全溶解,约加入0.1N NaOH 10ml。将溶解的酚红吸入100ml量瓶中,用双蒸水洗下研钵中残留的酚红液,并入量瓶中,最后补加双蒸水至100ml。
将1)液和2)液混合,补加双蒸水至1000ml即为原液B。
 
应用液: 
原液A 1份
原液B 1份
双蒸水 18份
混合后,分装于200ml小瓶中,高压灭菌。临用前用无菌的5.6%NaHCO3调PH至7.2~7.6。 

12、磷酸盐缓冲液的配制(PB)

A液(0.2mol/L NaH2PO4水溶液):
NaH2PO4•H2O 27.6g,溶于蒸馏水中,稀释至1000ml。

B液(0.2mol/L Na2HPO4水溶液): 
Na2HPO4•7H2O 53.6g 加蒸馏水溶解,加水至1000ml。

13、PBS的配制
配制PBS,只要在相应的PB基液中加入8.5g/L NaCl即可。 

 
二、常用激活剂

1、激活剂PMA:用DMSO配制成0.1mg/ml,分装20ul/管,-20度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1:100稀释储存液,终浓度为20ng/ml。

2、激活剂离子霉素:用乙醇配制成浓度为0.5mg/ml的储存液,-20度保存。实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1:10稀释储存液,终浓度为1ug/ml。

3、Staphylococcal enterotoxin B(SEB) :用无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL,4℃储存,SEB终浓度10ug/mL。

4、CD3:包被在培养板中,在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。

5、CD28:加速不同刺激剂(包括SEB、CD3等)的活化效应,浓度一般为10ug/ml。

6、阻断剂Bregeldin A:用DMSO配制成浓度为5mg/ml的储存液,分装20ul/管,-20度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1:10稀释储存液,在激活过程最后4~5小时使用BFA,终浓度为10ug/ml。

7、阻断剂莫能菌素:用DMSO配制成浓度为1mg/ml的储存液,4℃储存至少4个月,实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1:10稀释储存液,终浓度为2umol/L。

 

 

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